一级生物安全柜只可保护工作人员和环境而不保护样品。其原理和实通分柜类似，但是安全柜的排气口安装有安装过滤器。所生物安全柜在排气和进气口都需要使用过滤器。一级生物安全柜本身没有风机，依靠外接通风管中的风机带动气流，但是因为一级生物安全柜保护样品，如今已鲜少有人使用。

二级B型生物安全柜都是连接排气系统的安全柜。连接安全柜排气导管的风机连接紧急供应电源，在断电下仍可保持安全柜处于负压状态，不会市危险气体泄漏出实验室。

三级生物安全柜是为4级实验室生物安全等级而设计的，是目前安全防护等级最高的安全柜。柜体完全气密，全排放式，一切气体都不参与循环，工作人员则是通过连接在柜体的手套进行实验的，即手套箱，样品通过双门的传递箱进出安全柜以确保不受污染，适用于高风险的生物试验。

生物安全柜的工作原理主要是将柜内空气向外抽吸，使柜内保持负压状态，通过垂直气流来保护工作人员；外界空气经高效空气过滤器过滤后进入安全柜内，以避免处理样品被污染；柜内的空气也需经过HEPA过滤器过滤后再排放到大气中，可以有效的保护环境。